1 材料與方法

1.1 試驗飼料

試驗所用的發酵飼料由南(nán)京寶輝生(shēng)物(wù)飼料有限公司提供，該發酵飼料采用玉米、豆粕等優質原料作爲發酵底物(wù)，接種芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌等高活性益生(shēng)菌種，采用多菌種多底物(wù)好氧+厭(yàn)氧深度發酵技術制備。經測定，其主要營養指标如下(xià)：粗蛋白(bái)（以幹物(wù)質計）≥23.0%；粗脂肪（以幹物(wù)質計） ≥2%；粗纖維（ 以幹物(wù)質計） ≤6%；粗灰分(fēn)（ 以濕品計）≤5.0%；酸溶蛋白(bái)（ 占百分(fēn)比）≥25.0%；總酸（以乳酸含量計，以濕品計）≥3.0%；pH 值≤4.5；水分(fēn)含量（占百分(fēn)比）≤45.0%。配合飼料購自江蘇海普瑞飼料有限公司。對照組投喂配合飼料，命名爲F0；此外(wài)，設置四組試驗組，每組在日投喂量基礎上額外(wài)配伍日投喂量5%、10%、15%和20%的發酵飼料，并将各試驗組依次命名爲F5，F10，F15，F20。配合飼料營養組成見表1。

1.2 試驗蟹與養殖管理

試驗所用的中(zhōng)華絨螯蟹選自南(nán)京市浦口區的一(yī)個養殖池塘中(zhōng)，養殖試驗在南(nán)京市浦口區星甸鎮南(nán)京農業大(dà)學水産試驗基地的室外(wài)白(bái)皮桶中(zhōng)進行。在飼養試驗開(kāi)始之前，幼蟹要暫養在白(bái)皮桶中(zhōng)兩周，以适應白(bái)皮桶的養殖環境和飼料投喂的養殖模式。試驗共使用了150 隻大(dà)小(xiǎo)均一(yī)，體(tǐ)質健康，螯足健全的河蟹（平均初始體(tǐ)重1.01±0.16 g），将他們按公母比例1:1 随機分(fēn)爲5 組，每組設置3 個重複，每個重複爲10 隻河蟹，養殖于15 個白(bái)皮桶中(zhōng)（2×1.2×0.5 m，長:寬:高）。每個白(bái)皮桶中(zhōng)設置8 根PVC 管和适量的水葫蘆，以供河蟹躲避，防止相互殘殺。在整個試驗期間，白(bái)皮桶中(zhōng)持續充氣，定期換水1/3，每天監測水溫、pH 和溶解氧，并控制在24±5 ℃、8.0~8.6、5 mg/L。正式養殖試驗持續了59 d，直到幾乎所有的河蟹都完成了兩次脫殼，試驗才停止。在飼養過程中(zhōng)，每天喂食一(yī)次（17: 00），飽食投喂。投喂飼料的量根據天氣和飼養環境進行适當的調整，确保在投喂3 小(xiǎo)時後不留下(xià)餌料。每天觀察各組蟹的攝食、殘餌、死亡情況，做好詳細記錄以備分(fēn)析。我(wǒ)(wǒ)們保證所有有關于活蟹實驗的協議都遵守南(nán)京農業大(dà)學愛護與使用實驗動物(wù)的道德指導。本研究由南(nán)京農業大(dà)學動物(wù)保護與利用委員(yuán)會批準（許可證号: SYXK （Su） 2011-0036）。

1.3 樣品采集與分(fēn)析測定

1.3.1 樣品采集

采樣前，所有河蟹饑餓處理48 h，依次測量每隻河蟹的體(tǐ)重，用來計算增重率（WGR）和特定生(shēng)長率（SGR）。然後從每個白(bái)皮桶中(zhōng)随機選擇三隻河蟹進行取樣。每隻蟹抽取等量血淋巴用于指标測定。血淋巴抽取後立刻在4 ℃下(xià)3500 r/min 離(lí)心10 min，接着立刻吸取上層清液裝入離(lí)心管中(zhōng)保存于-20 ℃，用于後期抗氧化和免疫酶活性的測定。最後在無菌環境下(xià)完全采集了河蟹的肝胰腺并稱重，全部裝入凍存管中(zhōng)保存于-20 ℃，用于後期蛋白(bái)代謝酶活性的測定。

1.3.2 生(shēng)長指标及計算方法

蟹生(shēng)長相關指标：增重率（WGR）、特定生(shēng)長率（SGR）、存活率（SR）、肝體(tǐ)比（HSI）的計算公式如下(xià)：增重率（WGR，%）=(W1-W0)/W0×100特定生(shēng)長率（SGR，%）=(LnW1-LnW0)/D×100存活率（SR，%）=N1/N0×100肝體(tǐ)比（HIS，%）=W2/W3×100式中(zhōng)W0 爲蟹的初始體(tǐ)質量（g），W1 爲終末體(tǐ)質量（g），D 爲試驗養殖的天數（d），N0 爲試驗開(kāi)始時河蟹的數量（隻），N1 爲試驗結束時河蟹的數量（隻），W2 爲肝胰腺的重量（g），W3 爲相應河蟹的重量（g）。

1.3.3 血淋巴抗氧化指标測定

各酶活測定采用南(nán)京某科技有限公司提供的試劑盒。脂質過氧化物(wù)（LPO）的測定方法是在45 ℃溫度下(xià)，一(yī)共反應60min，一(yī)分(fēn)子LPO 會和兩分(fēn)子的顯色劑反應，最終産生(shēng)了穩定的生(shēng)色團，它在568 nm 下(xià)有最大(dà)吸收峰，使用标準曲線公式計算吸光度值得到檢測物(wù)中(zhōng)LPO 的含量；過氧化氫酶（CAT）的測定方法爲钼酸铵可迅速中(zhōng)止CAT 分(fēn)解過氧化氫的反應，加入钼酸铵後，未反應的過氧化氫與钼酸铵反應産生(shēng)淡黃色的絡合物(wù)，然後在405nm 處測定吸光度的變化量，就可以計算出CAT 的活力；總抗氧化能力（T-AOC）的測定方法是根據抗氧化物(wù)存在時，ABTS 生(shēng)成ABTS+的過程會被抑制，隻需要測定405 nm 處ABTS+的吸光度值就能計算出樣品的總抗氧化能力（T-AOC）。

1.3.4 血淋巴免疫指标測定

血淋巴中(zhōng)的酸性磷酸酶活性、總蛋白(bái)含量和白(bái)蛋白(bái)含量的測定均使用南(nán)京建成生(shēng)物(wù)工(gōng)程研究所提供的試劑盒。酸性磷酸酶（ACP）的測定是根據ACP 能将磷酸苯二鈉分(fēn)解爲遊離(lí)酚和磷酸，酚在堿性溶液中(zhōng)可以和4-氨基安替吡啉反應，最後被鐵氰化鉀氧化，生(shēng)成了紅色的醌衍生(shēng)物(wù)，根據紅色的深淺就能測定ACP 酶活性的高低；總蛋白(bái)含量的測定是利用在堿性條件下(xià)，蛋白(bái)能将Cu2+還原，而Cu與BCA 試劑反應形成了紫色絡合物(wù)，在562 nm 有最大(dà)吸收峰，吸光度值和濃度成正比關系，因此隻需要測吸光度即可進而計算出待測蛋白(bái)的濃度；白(bái)蛋白(bái)采用溴甲酚綠比色法。球蛋白(bái)含量=總蛋白(bái)-白(bái)蛋白(bái)，白(bái)球比=白(bái)蛋白(bái)/球蛋白(bái)×100。

1.3.5 肝胰腺蛋白(bái)代謝酶活性測定

測定胰蛋白(bái)酶、胃蛋白(bái)酶、Na+，K+-ATP 酶、谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶的試劑盒均購自南(nán)京某科技有限公司。爲測定肝胰腺中(zhōng)的胰蛋白(bái)酶、胃蛋白(bái)酶、Na+，K+-ATP 酶、谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶的活性，需要首先取樣品在9 倍體(tǐ)積的生(shēng)理鹽水中(zhōng)勻漿，然後在離(lí)心機上，4 ℃條件下(xià)，5000 r/min離(lí)心15 min，最後取出中(zhōng)層清液用于酶活性的測定。肝胰腺中(zhōng)胰蛋白(bái)酶活性的測定的原理是利用胰蛋白(bái)酶能催化水解精氨酸乙酯的酯鏈，并在253nm 處提升了吸光度。酶的活性大(dà)小(xiǎo)可以依據吸光度的前後變化來計算。肝胰腺中(zhōng)胃蛋白(bái)酶活性的測定原理是利用胃蛋白(bái)酶将底物(wù)蛋白(bái)質水解爲含酚的氨基酸，然後根據含酚氨基酸可以還原酚試劑得到藍(lán)色物(wù)質，采用比色法測定胃蛋白(bái)酶活性的高低。肝胰腺中(zhōng)Na+，K+-ATP 酶活性測定的原理是ATP 酶可以分(fēn)解ATP 形成ADP 和無機磷，隻需要測定産生(shēng)的無機磷的含量就可以得出ATP 酶活性的高低。肝胰腺中(zhōng)谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶的活性測定采用賴氏法。

1.4 數據統計與分(fēn)析

采用SPSS 25.0 軟件對試驗所得的數據進行細緻的統計分(fēn)析，第一(yī)步采用單因素方差分(fēn)析方法（one-way ANOVA），然後進行 Turkey’s 檢驗法進行多重比較以分(fēn)析所有數據的差異性。試驗數據統計時均以平均數±标準誤的形式表示，且數據都保留2 位小(xiǎo)數。若組間比較之後，P 值等于或小(xiǎo)于0.05，則認爲有顯著性差異（P ≤ 0.05）。

2 結果

2.1 發酵飼料配伍配合飼料投喂對中(zhōng)華絨螯蟹幼蟹生(shēng)長的影響

根據表2 可知(zhī)，在日投喂量基礎上額外(wài)投喂20%比例以下(xià)的發酵飼料後，各組增重率和特定生(shēng)長率均随着額外(wài)投喂比例的增加，呈現先升高後降低的趨勢，并且各處理組均較對照組顯著升高（P ＜0.05）。

幼蟹的存活率随着發酵飼料額外(wài)投喂量增多，而呈逐漸下(xià)降的趨勢，但是各處理組較對照組差異不顯著（P ＞ 0.05）。此外(wài)，各組間肝胰腺指數差異不顯著（P ＞ 0.05）。

2.2 發酵飼料配伍配合飼料投喂對中(zhōng)華絨螯蟹幼蟹抗氧化能力的影響

根據表3 可知(zhī)，随着額外(wài)投喂發酵飼料量的增加，幼蟹血淋巴中(zhōng)脂質過氧化物(wù)含量升高，但各處理組都低于對照組，且各組間數值差異不顯著（P ＞ 0.05）。

血淋巴中(zhōng)過氧化氫酶含量随着額外(wài)投喂發酵飼料量的增加呈現先升高後降低的趨勢，但都高于對照組，并且在額外(wài)投喂10%發酵飼料時達到最大(dà)值，其中(zhōng)F5、F10 和F15 組較對照組顯著升高（P＜ 0.05）。各組間血淋巴中(zhōng)總抗氧化能力随着額外(wài)投喂發酵飼料量的增加，呈現先升高後降低的趨勢，并且在F10 組達到最大(dà)，各處理組較對照組沒有顯著差異（P ＞ 0.05）。

2.3 發酵飼料配伍配合飼料投喂對中(zhōng)華絨螯蟹幼蟹非特異性免疫能力的影響

由表4 可以看出，各處理組幼蟹血淋巴中(zhōng)酸性磷酸酶活性均高于對照組，但是差異不顯著（P ＞0.05）。随着發酵飼料額外(wài)投喂量的提高，各組幼蟹血淋巴中(zhōng)總蛋白(bái)、白(bái)蛋白(bái)和球蛋白(bái)含量均呈現先升高後降低的趨勢，但是各處理組較對照組差異不顯著（P ＞ 0.05）。

随發酵飼料額外(wài)投喂量的增加，各組白(bái)球比先降低後升高，且各處理組較對照組無顯著差異（P＞0.05）。

2.4 發酵飼料配伍配合飼料投喂對中(zhōng)華絨螯蟹幼蟹蛋白(bái)代謝酶活的影響

根據表5 可知(zhī)，在日投喂量基礎上額外(wài)投喂20%比例以下(xià)的發酵飼料，幼蟹肝胰腺中(zhōng)胰蛋白(bái)酶和胃蛋白(bái)酶的活性随着投喂量的增加，呈現逐漸下(xià)降的趨勢，但都高于對照組，其中(zhōng)F5 組、F10 組、F15 組肝胰腺中(zhōng)胰蛋白(bái)酶活性較對照組顯著升高（P ＜ 0.05），F5 組胃蛋白(bái)酶活性較對照組顯著升高（P ＜ 0.05），其他處理組較對照組無顯著差異（P ＞ 0.05）。

由表5 可知(zhī)，随着發酵飼料投喂量增多，肝胰腺中(zhōng)谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性逐漸下(xià)降，但都高于對照組，其中(zhōng)F5 組谷草轉氨酶活性較對照組顯著升高（P ＜ 0.05），F5、F10 組谷丙轉氨酶活性較對照組顯著升高（P ＜ 0.05），其他處理組谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性則較對照組差異不顯著（P ＞ 0.05）。

3 讨論

3.1 發酵飼料配伍配合飼料投喂對中(zhōng)華絨螯蟹幼蟹生(shēng)長的影響

發酵飼料是以微生(shēng)物(wù)、複合酶爲生(shēng)物(wù)飼料發酵劑菌種，将飼料原料轉化爲微生(shēng)物(wù)菌體(tǐ)蛋白(bái)、生(shēng)物(wù)活性小(xiǎo)肽類氨基酸、微生(shēng)物(wù)活性益生(shēng)菌、複合酶制劑爲一(yī)體(tǐ)生(shēng)物(wù)發酵飼料。本試驗結果表明，發酵飼料配伍配合飼料投喂，可以顯著提升中(zhōng)華絨螯蟹幼蟹的增重率和特定生(shēng)長率，并且在額外(wài)投喂10%發酵飼料時，生(shēng)長性能達到最好，表明發酵飼料配伍配合飼料投喂能夠促進中(zhōng)華絨螯蟹幼蟹的生(shēng)長。研究已經發現，飼料經過發酵後，經曆了一(yī)系列的生(shēng)物(wù)化學反應，一(yī)部分(fēn)大(dà)分(fēn)子的纖維素和蛋白(bái)質被分(fēn)解成小(xiǎo)分(fēn)子，易于動物(wù)的消化吸收，從而提高了飼料中(zhōng)有機質和蛋白(bái)質的消化率。此外(wài)，飼料經過大(dà)量的益生(shēng)菌發酵後，擁有了特殊的酸香味和良好的适口性，可刺激動物(wù)的食欲，增加其采食量。因此，發酵飼料配伍配合飼料投喂，對中(zhōng)華絨螯蟹幼蟹的促生(shēng)長作用主要是因爲發酵飼料有更好的消化利用率、誘食作用和良好的适口性。

3.2 發酵飼料配伍配合飼料投喂對中(zhōng)華絨螯蟹幼蟹抗氧化能力的影響

在動物(wù)體(tǐ)内，抗氧化防禦體(tǐ)系主要通過抗氧化酶和還原性物(wù)質來消除細胞代謝過程中(zhōng)産生(shēng)的氧自由基，避免其對動物(wù)機體(tǐ)造成氧化損傷，是水生(shēng)動物(wù)應對應激和脅迫的重要生(shēng)理機制，關系到水生(shēng)動物(wù)的健康狀态。脂質過氧化物(wù)是機體(tǐ)中(zhōng)的活性氧與生(shēng)物(wù)膜磷脂中(zhōng)的多聚不飽和脂肪酸反應的産物(wù)，在氧化應激時，其含量會大(dà)幅升高，它們能與細胞中(zhōng)的大(dà)分(fēn)子物(wù)質如蛋白(bái)質和DNA 作用，進而引起細胞的氧化損傷，其含量的高低反映了動物(wù)體(tǐ)内脂質過氧化的水平。本試驗中(zhōng)随着發酵飼料額外(wài)投喂量的增加，幼蟹血淋巴中(zhōng)的脂質過氧化物(wù)含量先降低後升高，并且都低于對照組，說明發酵飼料的投喂減少了中(zhōng)華絨螯蟹體(tǐ)内的膜脂質過氧化産物(wù)，降低了過氧化水平。過氧化氫酶廣泛存在于動物(wù)體(tǐ)各組織中(zhōng)，其主要功能是催化細胞内的過氧化氫分(fēn)解，防止其氧化造成細胞損傷。徐奕晴等人的試驗發現提高飼料中(zhōng)生(shēng)物(wù)發酵飼料的含量，中(zhōng)華絨螯蟹幼蟹的肝胰腺中(zhōng)過氧化氫酶含量先上升後下(xià)降。本試驗中(zhōng)，幼蟹血淋巴中(zhōng)過氧化氫酶活性随發酵飼料額外(wài)投喂量的增多，呈現先上升後下(xià)降的趨勢，并均高于對照組，表明發酵飼料的投喂可以有效促進中(zhōng)華絨螯蟹幼蟹抗氧化能力的提高，并且在額外(wài)投喂10%時取得最好的促進效果。總抗氧化能力常被用作衡量動物(wù)體(tǐ)内抗氧化系統能力的綜合指标，它的高低可以反映機體(tǐ)對抗外(wài)來刺激的能力和代謝體(tǐ)内自由基的狀态。正常的情況下(xià)，動物(wù)在新陳代謝的過程中(zhōng)，氧自由基不斷生(shēng)成，又(yòu)不斷被消除，處在動态平衡中(zhōng)。本試驗中(zhōng)測得各組幼蟹血清中(zhōng)的總抗氧化能力無顯著差異，表明蟹體(tǐ)内氧自由基的生(shēng)成和及時清除均處于合理的動态平衡中(zhōng)。

3.3 發酵飼料配伍配合飼料投喂對中(zhōng)華絨螯蟹幼蟹非特異性免疫能力的影響

研究已經證明，蝦、蟹等甲殼動物(wù)不具有特異性免疫，它們主要依靠血淋巴中(zhōng)的免疫相關酶、免疫因子和酚氧化酶原激活系統等來進行免疫，稱爲非特異性免疫。血淋巴中(zhōng)酸性磷酸酶是溶酶體(tǐ)的重要組成部分(fēn)，具有吞噬細胞殺菌的作用，能夠消除外(wài)來物(wù)，進行機體(tǐ)的防禦。陳昌福等人采用免疫多糖對南(nán)美白(bái)對蝦進行腹腔注射後，發現其肝胰腺中(zhōng)的酸性磷酸酶活性提高，表明了體(tǐ)内免疫系統的激活。因此酸性磷酸酶活性可被用來評判甲殼動物(wù)的免疫能力。本試驗中(zhōng)觀察到随着發酵飼料額外(wài)投喂量的增加，酸性磷酸酶活性呈現先升高後降低，但都高于對照組的現象，可以認爲發酵飼料可以提升幼蟹免疫能力，并且在10%額外(wài)投喂時達到最好效果。血淋巴中(zhōng)總蛋白(bái)的含量除了能夠反映動物(wù)體(tǐ)内蛋白(bái)代謝和營養吸收的水平，它同時也與機體(tǐ)的免疫有密切的關聯。血淋巴中(zhōng)的球蛋白(bái)主要參與動物(wù)機體(tǐ)的體(tǐ)液免疫，因此其含量的升高可以反映機體(tǐ)的免疫力提高。研究表明，飼料經益生(shēng)菌發酵後投喂仔豬，其血清中(zhōng)的總蛋白(bái)以及球蛋白(bái)含量均提高。在本試驗中(zhōng)，發酵飼料配合基礎飼料投喂後幼蟹血淋巴中(zhōng)總蛋白(bái)和球蛋白(bái)含量均較對照組升高，說明發酵飼料對幼蟹的健康生(shēng)長有正向促進作用，并且可以提高幼蟹的免疫能力。

3.4 發酵飼料配伍配合飼料投喂對中(zhōng)華絨螯蟹幼蟹蛋白(bái)代謝酶活的影響

蛋白(bái)酶的主要作用是催化蛋白(bái)質的水解，而谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶是肝髒中(zhōng)最重要的氨基轉移酶，與機體(tǐ)的氨基酸代謝密切相關。大(dà)量研究已經證明，肝胰腺中(zhōng)蛋白(bái)酶活性和轉氨酶活性的升高，說明了動物(wù)體(tǐ)内蛋白(bái)質的吸收和氨基酸的代謝更爲旺盛，表明動物(wù)體(tǐ)對飼料中(zhōng)的蛋白(bái)質利用率升高。Abasubong 等在飼料中(zhōng)添加低聚木糖後，觀察到團頭鲂肝髒中(zhōng)谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性升高，日增長指數升高。Ketnawa 等模拟了豬體(tǐ)外(wài)消化發酵豆粕的試驗，發現豆粕經過發酵後改善了蛋白(bái)質的消化率。一(yī)方面在多菌種混合發酵飼料的過程中(zhōng)，菌種會産生(shēng)大(dà)量蛋白(bái)酶，随飼料進入動物(wù)體(tǐ)後促進動物(wù)的消化吸收；另一(yī)方面飼料經過發酵後，其中(zhōng)的大(dà)分(fēn)子蛋白(bái)質被分(fēn)解爲小(xiǎo)分(fēn)子的肽類，而抗營養因子如胰蛋白(bái)酶抑制因子、植物(wù)凝集素、植酸等則大(dà)部分(fēn)被去(qù)除，有利于動物(wù)對蛋白(bái)的吸收。本試驗中(zhōng)，随着發酵飼料額外(wài)投喂量的增加，幼蟹肝胰腺中(zhōng)胰蛋白(bái)酶、胃蛋白(bái)酶、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶活性均呈現先升高後降低的趨勢，并且都高于對照組，表明了發酵飼料的額外(wài)投喂可以有效促進幼蟹的蛋白(bái)質和氨基酸的代謝，最終促進了中(zhōng)華絨螯蟹幼蟹的生(shēng)長發育。本試驗的結果表明，在配合飼料投喂的基礎上，額外(wài)投喂日投喂量20%以下(xià)的發酵飼料，中(zhōng)華絨螯蟹幼蟹生(shēng)長性能顯著升高，抗氧化和免疫能力加強，蛋白(bái)酶和轉氨酶活性提升，并且對生(shēng)長、抗氧化和免疫能力的促進作用均在10% 額外(wài)投喂量時達到最理想效果。說明發酵飼料的額外(wài)投喂對中(zhōng)華絨螯蟹的生(shēng)長、抗氧化、免疫和蛋白(bái)代謝各方面均有益處，并且最适宜額外(wài)投喂量爲10%。
  參考文獻（略）。